k418 - page 68

ВестникНОМУС. Сборникматериалов конкурса литературных обзоров-2012
68
для микроскопии. Обработка образцов в буфере с высоким содержанием соли
приводила к лизису клеточных мембран и экстракции белков. Молекулы ДНК
разделяли электрофорезом, треки ДНК визуализировали посредством
окрашивания флуоресцентным красителем, после чего образцы изучали
микроскопически. При наличии разрывов ДНК нарушается структурная
организация хроматина и утрачивается сверхспирализация ДНК, что приводит
к релаксации этой биомакромолекулы, формируются фрагменты ДНК, не
связанные с клеткой. В электрическом поле релаксированные петли и
фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, что и придает
наблюдаемым объектам вид « комет» (отсюда и произошло название «comet
assay», ставшее общеупотребительным). «Кометы» анализируют либо путем
визуального наблюдения и дифференциации «комет» по степени
поврежденности ДНК, либо с использованием компьютерных программных
средств обработкиизображений [19].
В 1988 г. Был описан новый вариант метода ДНК-комет,
предполагающий проведение после лизиса клеток контролируемой
денатурации ДНК и электрофорез в щелочной среде, что позволило
детектировать однонитевые разрывыДНК ищелочелабильные сайты (разрывы
ДНК в них образуются в щелочных условиях), а также повысить
чувствительность метода и воспроизводимость результатов [26]. Методом
ДНК-комет, проводимым в нейтральных условиях среды, детектируют
преимущественнодвунитевые разрывыДНК [33].
В настоящее время большинство лабораторий, внедривших данный
методический подход в исследования, разработали многочисленные вариации
протокола, в частности продолжительности и условий лизиса клеток,
денатурации, электрофореза и окрашивания ДНК. Анализ «ДНК-комет» может
проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса.
При визуальном анализе «ДНК-кометы» ранжируются на пять условных типов
с соответствующимчисловым значениемот 0 до 4.
Степень поврежденности ДНК при этом выражается как индекс « ДНК-
комет» (ИДК), определяемыйпоформуле:
ИДК = (0n0+1n1+2n2+3n3+4n4) / Σ,
Где n0-n4— число «ДНК-комет» каждого типа,
Σ — сумма подсчитанных «ДНК-комет» [28].
Программно -аппаратный комплекс включает совмещенную с
микроскопом высокочувствительную камеру и специализированное
программное обеспечение, что позволяет проводить цифровую регистрацию и
обработкупараметров «ДНК-комет», характеризующих целостность структуры .
В качестве показателя поврежденности ДНК, чаще всего используют длину
«хвоста», %ДНК в «хвосте» или их произведение — так называемый момент
«хвоста» [18].
Очевидно , что не существует одного метода, способного выявлять все
генотоксические воздействия. Поэтому общепринятым является использование
набора тестов in vivo и in vitro. Сравнение метода ДНК-комет с другим