Упрощенная HTML-версия
M.tuberculosis (отражает факт наличия или отсутствия антигена). Принцип метода состоит в
циклическом повторении трех стадий реакции:
1) денатурации ДНК при нагревании;
2) гибридизации искусственно синтезированных олигонуклеотидов с фланговыми
участками цепей амплифицируемого фрагмента ДНК (так называемых «праймеров» или
«затравочных» фрагментов);
3) синтеза (достройки) цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-
полимеразы. Многократное удвоение цепей ДНК (30-40 циклов) позволяет в течение
нескольких часов умножить (амплифицировать) специфический участок ДНК в
геометрической прогрессии, а затем идентифицировать его (при электрофорезе в агарозном
геле в присутствии красителя этидия бромида синтезированный фрагмент ДНК выявляется в
виде светящейся под действием ультрафиолета полосы).
Высокая чувствительность (теоретически возможно определять единичные
M.tuberculosis в образце) и быстрота проведения анализа (1-2 дня) чрезвычайно ценны для
клинической практики. Проблема специфичности ПЦР в диагностике туберкулеза
обусловлена высоким риском ложноположительных результатов, поскольку продукты
амплификации (фрагменты ДНК) легко могут попасть в исследуемые образцы и служить
матрицей для новых реакций. По данным И.Б.Викторова и А.Л.Ханина (2003)
чувствительность ПЦР 14,3%, специфичность 87,5%.
По результатам исследования Е.А.Марениной ДНК МБТ методом ПЦР в крови
определяли у 59,3% детей с усиливающейся туберкулиновой чувствительностью и у 60,9%
детей при гиперергических реакциях на пробу Манту с 2 ТЕ. В группах риска по результатам
туберкулинодиагностики положительные результаты ПЦР на ДНК МБТ были выявлены у
60,3% детей. У детей из группы с установленным диагнозом локального туберкулеза
положительные результаты на наличие ДНК МБТ в крови установлены в 46,8%.
Таким образом, несмотря на высокую специфичность данного метода (исключая
технические погрешности) для ранней диагностики туберкулезной инфекции имеет низкую
чувствительность, а использование ПЦР с целью дифференциальной диагностики
инфекционной аллергии и парааллергии не представляется возможным.
Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с туберкулином (ППД-Л).
Данная
реакция служит для оценки состояния специфического клеточного иммунитета (появление
сенсибилизированных лимфоцитов является в отличие от образования антител очень ранним
специфическим этапом иммунного ответа) и используется в клинике (особенно в комплексе с
рядом других иммунологических тестов) для дифференциальной диагностики туберкулеза,
оценки активности его течения и выявления минимальной активности туберкулезных
поражений. Механизм этой реакции состоит в трансформации лимфоцитов в бластные клетки
под действием специфического митогена – туберкулина. Реакция состоит из 3-х этапов:
1) выделение лимфоцитов (или лейкоцитарной массы);
2) культивирование лимфоцитов (лейкоцитов) с ППД-Л;
3) оценка результатов.
Данную реакцию можно оценивать морфологическим методом (подсчет визуальный в
окрашенных мазках - может давать субъективные ошибки), а также по степени активности
включения іН-тимидина (используя для этого автоматический сцинтилляционный счетчик).
При культивировании лимфоцитов в подопытные флаконы в культуральную жидкость
вносят туберкулин (туберкулин-сухой лиофилизированный, Ленинградский ин-т вакцин и
сывороток). Оптимальная конечная концентрация его составляет 60 мкг/мл. Флаконы,
содержащие клетки и необходимые ингредиенты для их культивирования, помещают в
термостат при 37°С и инкубируют в течение 4-х суток (96 часов).