Упрощенная HTML-версия
анализатор хемилюминограмм АХЛГ-2-01, а также другие разрешенные к применению в
медицинской практике в установленном порядке хемилюминометры. Световой микроскоп.
Лабораторные животные.
Беспородные белые крысы весом 180-200 г.
ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ МЕТОДА
Метод состоит из двух частей. Определение антиоксидантной способности вещества
осуществляется в суспензии перитоне-альных макрофагов, активированных хризотил-
асбестом. Исследование хелатирующих свойств вещества проводится в модельной
бесклеточной системе, содержащей пероксид водорода и хризотил-асбест. Метод
заключается в измерении интенсивное? : хемилюминесценции в обеих системах с помощью
любого разрешенного к применению в медицинской практике хемилюмино-метра, имеющего
систему термостатирования и перемешивания.
Определение антиоксидантной способности препарата
За сутки до выделения перитонеальных макрофагов белым крысам перестают давать
пищу. В день определения под эфирным наркозом крысам внутрибрюшинно вводят 15 мл
раствора Хенкса с 5 ед/мл гепарина, подогретого до 37°С. Брюшко массируют 3-5 минут.
Затем животных забивают декапитацией. Вскрывают брюшную стенку, пастеровской
пипеткой отсасывают содержимое перитонеальной полости и фильтруют его через двойной
слой аптечной марли. Суспензию центрифугируют при 400 g = течение 10 минут.
Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в 10 мл среды Хенкса и снова осаждают
центрифугированием Процедуру отмывки повторяют дважды. Окончательно ресуспендируют
клетки в 1,0 мл среды Хенкса. Все процедуры по выделению клеток проводят при 4°С
(температуре тающего льда). Подсчитывают количество клеток в камере Горяева и доводят
средой Хенкса до концентрации 5,0 х 10 -6 мл -1 .Хранят клетки при температуре тающего
льда и используют для работы в течение 4-5 часов.
Рекомендуется проверять жизнеспособность выделенных клеток с помощью теста с
трипановым синим. Для этого к 0,1 мл суспензии клеток добавляют 0,1 мл 0,1% раствора
трипанового синего на 0,9% NaCI. Подсчитывают число нежизнеспособны-клеток с
интенсивно окрашенной цитоплазмой и ядром. Для работы используют суспензию с
содержанием жизнеспособных клеток не менее 85%.
Для определения антиоксидантной способности препарата в измерительную кювету
хемилюминометра помещается 0,85
\т.
среды, содержащей 110мМNаС1, 10мМтрис-HCI (рН
7,4), 5 мМ D-глюкозы, 2,5 мМ MgCI 2 x2H 2 On0,65 мМ люминола(рН 7.4-7,5). Затем в кювету
добавляется 0,1 мл суспензии клеток, регистрируют интенсивность клеточной
хемилюминесценции (ХЛ) измерительной кювете при температуре 37°С+0,5°С и постоянном
перемешивании содержимого кюветы, чтобы не допустить осаждения клеток и волокон
асбеста. Через 3-5 минут измеряют уровень спонтанной ХЛ макрофагов. Послеэтого в кювету
вводят 0,05 мл исследуемого препарата и в течение 3-4 минут наблюдают за изменением
уровня ХЛ, определяя влияет ли исследуемый nper.iрат на окислительный метаболизм
макрофагов. Если влияние отсутствует, в кювету вводят 0,05 мл физиологического раствора с
0,3 мг хризотил-асбеста. Измеряют максимальный уровень свечения (ХЛ опыт ). Обычно он
достигается за 3-4 минуты.
В следующей пробе в кювету хемилюминометра помещается суспензия клеток и
хризотил-асбеста (в отсутствии исследуемого препарата) и также отмечается максимальный