Упрощенная HTML-версия
с исследуемым веществом. По истечение срока инкубации клетки снимают с подложки и
переносят на мембранные фильтры, где проводят процедуру лизиса с последующей
промывкой выделенной ДНК. Затем проводят щелочную элюцию ДНК и отбор элюатов без
фракционирования. Содержание ДНК в элюатах определяют в кислотонерастворимой
фракции, которую сорбируют на мембранные фильтры. Радиоактивность меченого тритием
тимидина, оставшуюся на фильтрах, определяют на сцинтилляционном счетчике.
Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной активирующей смеси и
без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так и непрямых, активность
которых связана с образованием мутагенных метаболитов, учитываемых при работе с
микросомальной фракцией.
6.9.3. Данные и их представление
6.9.3.1. Обработка результатов
Полученные результаты выражают в виде % ДНК, оставшейся на фильтре. При этом
используют следующую формулу:
F =
где F - % ДНК (активность в имп/мин), оставшейся на фильтре после элюции; A F
активность, оставшаяся на фильтре;
А Е - активность, обнаруженная в элюате в пересчете на полныйего объем.
Для расчетов используют среднее арифметическое всех независимых параллелей
эксперимента в том случае, если их результаты не различаются больше, чем на 3 s.
6.9.3.2. Оценка результатов
Наличие у изучаемого вещества ДНК-повреждающего действия регистрируют при
обнаружении достоверных различий между % оставшейся на фильтре ДНК в контрольных и
опытных вариантах.
Достоверность различий определяют с использованием критерия Стъюдента.
Если ни в одном из вариантов не получено позитивных результатов, эксперимент
прекращают. Таким же образом поступают, если обнаружен эффект с четкой дозовой
зависимостью. Если эффект получен только на одной концентрации, эксперимент повторяют
с использованием схемы 2 этапа.
Отчет должен включать следующую информацию:
– использованные клетки;
– условия проведения теста: уровни концентраций и обоснование выбора
концентраций, количество повторностей на экспериментальную точку, состав среды, тип и
состав системы метаболической активации, методика обработки, негативные контроли;
– индивидуальные результаты для каждой параллели;
– средние значения всех показателей;
– стандартное отклонение;
– уровень значимости различий с сериями негативного контроля.
6.9.3.3. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое соединение
или его метаболиты индуцируют одно-нитевые разрывы ДНК или щелочелабильные сайты.