Упрощенная HTML-версия
6.9. Метод определения однонитевых разрывов ДНК клеток млекопитающих
методом щелочной элюции
6.9.1. Цель исследования и принцип метода
Метод основан на определении кинетики прохождения через мембранные фильтры
однонитевых фрагментов ДНК, которые образуются при денатурации ДНК в присутствии
щелочи. Скорость элюции ДНК определяется скоростью денатурации ДНК, которая зависит
от числа разрывов или щелочелабильных сайтов, индуцированных исследуемым
соединением или его метаболитами.
6.9.2. Процедура тестирования
6.9.2.1. Клеточные культуры
Используют культуры постоянных клеточных линий, например, клетки легкого
китайского хомячка линии V-79, клетки яичника китайского хомячка СНО или культуры
мышиных клеток L.
6.9.2.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется фракция S9 печени
крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за 5 суток до
забоя).
6.9.2.3. Изучаемые концентрации
Используется двухэтапная схема тестирования. Используются следующие конечные
концентрации: 0,1; 1,0; 10,0 и 100,0 мкг/мл. При обнаружении эффекта только при действии
одной концентрации вещества эксперимент повторяют в диапазоне концентраций в 2 и 5 раз
больших и меньших (2 этап).
6.9.2.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательным является постановка негативного контроля,
которым является растворитель. В качестве растворителя используются дистиллированная
вода или диметилсульфоксид в конечной концентрации 1 % , а при необходимости - другие
растворители, которые используют в концентрациях, не вызывающих токсического эффекта.
В качестве позитивных контролей используют диметилнитрозамин, метилметансульфонат и
др. (Williams, 1985).
6.9.2.5. Проведение эксперимента
Последовательность операций, связанных с подготовкой и проведением эксперимента,
а также процедура оценки полученных данных и квалификация результатов испытаний
описана в соответствующих руководствах (Venitt et al., 1986).
Для проведения эксперимента клетки тестерной линии предварительно культивируют
в среде Игла или RPMI 1640 с 15% инактивированной сывороткой крупного рогатого скота,
содержащей меченый тритием тимидин до появления монослоя. Затем культуры инкубируют