Упрощенная HTML-версия
Исследование спонтанной и индуцированной митогенами пролиферации
спленоцитов
Иммунотропные, митогенные, а в ряде случаев и аллергенные свойства исследуемых
препаратов можно оценить с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов.
Использование этого подхода с применением Т- и В-клеточных митогенов позволит также
оценить преимущественное влияние фармпрепаратов на Т- или В- клеточные популяции
лимфоцитов.
Постановка реакции. Животных опытных и контрольных групп забивают с помощью
цервикальной дислокации, извлекают селезенку и готовят клеточную суспензию при помощи
стеклянного гомогенизатора. Полученные спленоциты отмывают средой 199 с 5% сыворотки
крупного рогатого скота и по 200 мкл клеточной взвеси (с концентрацией 2x10 6 /мл) в среде
RPMI-1640 (Flow, Англия), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco,
США), 0,01 М буфера HEPES (Gibco, США), 200 мМ L-глутамина (Sigma, США), 10 шМ 2-
меркаптоэтанола (Merck, ФРГ), 100 мг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина, вносят в
лунки 96-луночных планшетов. В часть лунок одновременно вносят митогены (ФГА, ЛПС) в
предварительно оттестированных концентрациях (10-20 мкг/мл). Контрольные лунки
митогена не содержат. При наличии инъекционной или растворимой формы исследуемого
препарата проводят оценкуих митогенных свойств, помещая в различных концентрациях в
лунки, содержащие спленоциты интактных животных. Внесение же препаратов в
максимальной, не митогенной концентрации в культуру спленоцитов животных, получавших
препарат, позволит судить о возможности сенсибилизации организма животных к препарату
в случае повышения пролиферации при повторном контакте с препаратом спленоцитов
животных опытных групп.
Затем селезеночные клетки инкубируют в течение 96 часов в атмосфере 5% СО 2 , при
температуре 37,5°С и за 24 часа до окончания культивирования в лунки добавляют по 1 мкКИ
раствора 3 Н-тимидина в объеме 10 мкл. Интенсивность включения 3 Н-тимидина (число
импульсов/мин) определяют в клетках, собранных с помощью Cell Harvester (Flow), на
сцинтилляционном счетчике (Магск-Ш).
Уровень РБТЛ спленоцитов под влиянием митогенов или вносимых в среду
культивирования препаратов оценивают по отношению к интенсивности РБТЛ спленоцитов в
среде, не содержащей митогены или используемые препараты. Для оценки влияния
препаратов на РБТЛ сравнивают величину включения 3 Н-тимидина клетками селезенки
мышей, получивших препараты, с таковой спленоцитов мышей, получивших
физиологический раствор (ФР). Результаты выражают в значениях импульсов в минуту.
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Патоморфологические исследования
Иммунокомпетентные органы - тимус, селезенку, лимфатические узлы различной
локализации, фрагменты тонкого кишечника, включающие групповые лимфатические
фолликулы (Пейеровы бляшки), - рекомендуется фиксировать в жидкости Буэна (Ромейс Б.,
1954, 305) в течение 24 часов.
Обезвоживание и проводку образцов, заливку в парафин с воском проводят по
общепринятой в гистологии технике.