Упрощенная HTML-версия
Оценка активности нейтрофилов в тесте хемилюминесценции
В
качестве источника нейтрофилов используют пуллированную венозную кровь
мышей, взятую в ЭДТА (1,5 мг/ мл). Образцы крови (0,5-1 мл) лизируют добавлением 12-15
мл лизирующего раствора (NH 4 CI 8,26 г/л и NaHCO 3 1 г/ л, рН 7,2). После 7-минутной
экспозиции при комнатной температуре и центрифугирования (9 минут при 200 g), гемолизат
удаляется, осевшие клетки ресуспендируют в 1 млбуферного раствора (рН 7,2),
приготовленного из раствора Хенкса (без фенолового красного), дополненного 5 мМ
глюкозы, 10 мМ HEPES-буфера, 0,62 х 10 3 М люминола (Sigma Chemical Co.). По 100-50 мкл
суспензии помещают в пробирки для хемилюминесценции, вносят 0,5 мл упомянутого
буферного раствора с добавлением люминола и помещают в ячейки хемилюминометра. Для
активации хемилюминесцентной реакции нейтрофильных гранулоцитов используют
опсонизи-рованный зимозан (Sigma Chemical Co.). Образцы клеток инкубируют в течение 15
мин, затем добавляют 10-20 мкл опсонизиро-ванного зимозана (10 мг/мл) и регистрируют
уровень и кинетику хемилюминесценции в течение 30 минут. Интенсивность хеми-
люминесцентного ответа оценивают по максимальному значению на кинетической кривой.
Среднее значение интенсивности хемилюминесценции определяют по данным не меньше
трех идентичных измерений. Результаты оценивают количественно по числу импульсов в
минуту на 1 мкл крови и на количество нейтрофилов в 1 мкл.
Аналогичные исследования можно проводить, используя в качестве источника
фагоцитов клетки перитонеального экссудата и спленоциты.
Оценка влияния препаратов
на гиперчувствительность замедленного типа
О
состоянии клеточного иммунитета животных после введения им фармакологических
препаратов
можно
судить
по
способности
мышей
к
индукции
реакции
гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ) и тринитро-
бензолсульфоновой кислоте (ТНБС). Использование двух разных антигенов позволяет с
большей вероятностью выявить стимулирующий или ингибирующий эффект препаратов, так
как эти реакции различаются по своей интенсивности (очень высокая в случае ТНБС). При
использовании только одного антигена предпочтение следует отдать ТНБС в силу
высказанных выше причин.
По окончании курса введения препарата мышей-самцов (CBAxC57BL/6)Fl
иммунизируют подкожно эритроцитами барана (2 х 10 8 ) в межлопаточную область или 10
мМ раствором ТНБС (0,2 мл) в основание хвоста. Вторую (разрешающую) инъекцию
антигена производят на 5-е сутки в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (50 мкл
суспензии ЭБ, содержащей 10" клеток) или на 6-е сутки (50 мкл 10 мМ раствора ТНБС). В
контрлатеральную лапу вводят 50 мкл стерильного физиологического раствора
(«контрольная лапа»). Результаты реакции регистрируют через 24 ч путем определения
массы «опытной» и «контрольной» лап. Индекс реакции для каждого животного определяют
по формуле:
где Моп и Мк - масса «опытной» и «контрольной» лап. При статистической обработке
определяют среднюю арифметическую показателей и стандартную ошибку. Достоверность
различий определяют по критерию t Стьюдента.