Упрощенная HTML-версия
Содержимое пробирок встряхивают и выливают на чашки Петри (диаметр чашки 100 мм).
Осторожным покачиванием и вращением смесь равномерно распределяют по дну чашки.
После застывания агарозы чашки помещают в термостат при 37,5°С на 1 час. Затем на
поверхность агарозы в чашках наливают по 3 мл раствора сухого комплемента морской
свинки (разведение в физиологическом растворе 1:5) и вновь инкубируют в термостате при
37 °С в течение 45 мин. После инкубации комплемент сливают и проводят подсчет
образовавшихся бляшек (зон гемолиза). При относительно небольшом числе бляшек
(примерно до 120 на чашку) их подсчитывают полностью. Если же бляшек больше, то их
подсчет производят следующим образом. В листе плотной черной бумаги вырезают
отверстие в форме квадрата со стороной 1 см (т.е. площадью 1 см 2 ). Подкладывая лист с
вырезанным квадратом под донышко чашки, просчитывают выборочно число бляшек в 10
таких квадратах в разных участках чашки с последующим перерасчетом на всю поверхность
агарозы в чашке (коэффициент перерасчета для чашек диаметром 100 мм равен 6,88). Зная
объем клеточной суспензии, наносимый на чашку, и общий объем селезеночной суспензии
вычисляют количество бляшек (АОК) на всю селезенку.
При статистической обработке полученных данных определяют среднюю
геометрическую числа АОК и стандартную ошибку. При сравнении результатов применяют
критерий t Стьюдента. Достоверными считают различия при Р<0,05. При постановке
экспериментов необходимо использовать не менее 6-10 животных в группе. Итоговые
результаты являются суммарными показателями по крайней мере 2 опытов.
Реакцию Ерне можно заменить определением на 7-е сутки после иммунизации титра
антител в сыворотке крови мышей с помощью реакции гемагглютинации.
Оценка фагоцитарной активности
перитонеальных макрофагов
Для фагоцитоза можно использовать различные частицы (меченые эритроциты,
дрожжевые тельца, частицы латекса и др). Здесь приводится описание фагоцитоза частиц
коллоидной туши.
По окончании введения мышам исследуемого препарата через 24 часа оценивают у
них фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов по интенсивности захвата ими
частиц туши, введенной животным внутрибрюшинно в виде 0,05% суспензии в объеме 2 мл.
Через 10 мин брюшную полость промывают 5 мл изотонического раствора хлорида натрия.
Полученные таким образом клетки перитонеального экссудата (КПЭ) трижды отмывают,
ресуспендируют в 1 -2 мл физиологического раствора, подсчитывают концентрацию ЯСК и
процент фагоцитирующих клеток. Далее клетки осаждают центрифугированием, супернатант
удаляют, а осадок КПЗ лизируют дистиллированной водой. Лизаты КПЭ затем помещают в
плоскодонные планшеты и определяют с помощью спектрофотометра «Multiscan MCC 340»
при длине волны равной 620 нм оптическую плотность, отражающую количество туши,
поглощенной перитонеальными фагоцитами. Результаты выражают в условных единицах,
отражающих оптическую плотность лизата КПЭ, соотнесенную с количеством фа-
гоцитирующих клеток.
Исследования позволяют оценить:
– концентрацию и количество ядросодержащих клеток в ПЭ;
– процент и количество фагоцитирующих клеток в ПЭ;
– суммарное количество туши, поглощенной КПЭ;
– количество туши, поглощенной одним фагоцитом (фагоцитарный индекс).