Упрощенная HTML-версия
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Опыт работы позволяет авторам предложить следующие варианты постановки
вышеуказанных методов
Определение массы и клеточности органов иммунной системы
Мышей забивают с помощью цервикальной дислокации, извлекают тимус, селезенку,
лимфатические узлы и трубчатые кости. Лимфоидные органы взвешивают и с помощью
стеклянного гомогенизатора, готовят клеточную взвесь на среде 199 или на растворе Хенкса
(рН 7,4). Полученную суспензию фильтруют через 2 слоя капрона и дважды отмывают путем
центрифугирования при 200 g в течение 5 мин. Средой 199 из костей вытесняют и затем
гомогенизируют костный мозг. Далее подсчитывают концентрацию ядросодержащих клеток
(ЯСК) в 3% уксусной кислоте. Результаты выражают в абсолютных единицах числа ЯСК в
органе и в относительных значениях по отношению к массе органа.
Определение числа антителообразующих клеток (АОК)
Метод основан на образовании вокруг клеток, продуцирующих антитела с высокой
гемолитической активностью (lgM-ан-титела), сферической зоны лизиса после добавления
антигена и комплемента. Существует значительное количество модификаций метода Ерне и
Нордина, поэтому исполнители могут выбрать вариант, оптимально отвечающий задаче
конкретного исследования.
Мышам вводят внутрибрюшинно или внутривенно суспензию трижды отмытых в
стерильном физиологическом растворе эритроцитов барана (ЭБ) в субоптимальной дозе,
равной 5 х 10 7 ЭБ/мышь. Рекомендуется, чтобы пути введения антигена и тестируемого
препарата различались. Поэтому препарат согласно предполагаемому способу клинического
использования вводят иным путем в 2 дозах по схемам, указанным выше. На 5-е сутки после
иммунизации при внутрибрюшинном введении (на 4-е сутки после внутривенной
иммунизации) определяют число АОК в селезенке. Целесообразно также проведение реакции
локального гемолиза на предмет обнаружения возможного влияния на спонтанное
бляшкообразование (в эксперимент добавляют 3 группы без введения ЭБ: две с введением
препарата и одна - интактные животные). Наличие эффекта поликлональной активации будет
свидетельствовать о риске развития аутоиммунного состояния.
Постановка реакции. Животных забивают с помощью цервикальной дислокации,
извлекают селезенки и готовят клеточную суспензию при помощи стеклянного
гомогенизатора. Суспендирование проводят в растворе Хенкса (рН 7,2-7,4) в объеме 5 мл на
холоде. Приготовленную суспензию фильтруют через 1 слой капрона и помещают в
холодильник.
Приготовление агарозной смеси. Расплавленную в дистиллированной воде 2% агарозу
(пригодна агароза различных фирм) добавляют к равному объему нагретого до 45-48 °С
однократного и двукратного (10-кратный концентрат, разведенный в 5 раз дистиллированной
водой) раствора Хенкса. Соотношение компонентов смеси - 1:1:1. В приготовленную таким
образом агарозу вносят суспензию ЭБ (концентрация 6-8 млрд/мл) из расчета 70-80 млн.
клеток на 1 мл агарозной смеси. По 2,75 мл полученной смеси разливают по пробиркам,
предварительно помещенным в водяную баню с температурой 46-48 °С. Далее в пробирки,
содержащие агарозу с ЭБ, вносят определенное количество суспензии селезеночных клеток
(как правило, 0,05-0,2 мл), желательно определить его в предварительных опытах.