Упрощенная HTML-версия
Вскрывают брюшную полость по средней линии и отсасывают взвесь ТК пипеткой или
сливают в пробирки. Эритроцитов не должно быть. Тучные клетки осаждают
центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин и готовят в растворе Хенкса 10 мл
взвеси ТК с концентрацией 10 5 кл/мл. Для подсчета клеток используют 0,1% раствор
нейтрального красного.
Выявление гистаминолибераторного действия исследуемого вещества:
а) в
предварительном
эксперименте
подбирают
нетоксическую
дозу
фармакологического вещества;
б) с целью инкубации с исследуемым веществом ТК разливают в 2 параллельные
пробирки по 1 мл в указанной концентрации. К взвеси добавляют по 100 мкл тест-препарата
в нетоксической для ТК концентрации. Пробирки слегка встряхивают и инкубируют в
течение 10 мин при температуре 37 °С. Для остановки процесса гистаминолиберации в
пробирки добавляют по 1,5 мл охлажденного раствора Хенкса, центрифугируют 5-10 мин при
1000-1500 об/мин и надосадок сливают в чистые пробирки для определения выделившегося
гистамина. К осадкам добавляют 0,1 мл 1% раствора трилона Х-100, выдерживают при
комнатной температуре 5-7 мин, добавляют 2,5 мл раствора Хенкса.
В качестве контроля используют:
1пробирка - стандартный раствор гистамина (1 мкг/мл 100% содержание гистамина);
2пробирка - раствор Хенкса (флюоресценции не должно быть);
3пробирка - 1 мл взвеси ТК в концентрации 10 5 ;
4пробирка - 1 мл рабочего раствора Хенкса.
3 и 4 пробирки ставятся для проверки чистоты реактивов. Исследуемое вещество
оценивают на степень спонтанной флюоресценции или способность ее ингибиции.
4.2. Реакция конденсации с ортофталевым альдегидом (ОФА)
В четыре опытные пробирки (2-е надосадочной жидкостью и 2 - с тучными клетками,
лизированными трилоном) и контрольные 3 и 4 добавляют по 0,2 мл ЗМ NaOH и 0,1 -0,2 мл
ОФА. Обязательно встряхивают каждую пробирку сразу же после добавления ОФА. Через 4
мин добавляют 0,15 мл 1,5% Н 3 РО 4 (среда должна быть кислая). Флюориметрия [18] - через
10 мин после стабилизации раствора ортофосфорной кислотой, измеряют флюоресценцию на
спектрофлюориметре Хитачи НРр-4. Сначала измеряют величину свечения контрольных
проб, затем опытных образцов. Процент выхода гистамина рассчитывают по формуле:
где:
А – процент выделившегося гистамина из ТК (надосадочная жидкость);
В – процент гистамина оставшегося в ТК (осадок ТК).
Определение рабочей зоны тест-препарата осуществляется опытным путем. Обычно
это уже 10 4 — 10* молей. К 900 мкл суспензии ТК в концентрации 10 6 добавляют 100 мкл
исследуемого вещества (инкубируют 10-15 мин в термостате при 37 °С. Затем подсчитывают
живые клетки по исключению трипанового синего (каплю клеточной суспензии при
комнатной температуре смешивают с каплей 0,1% раствора трипанового синего и через 1-3
мин подсчитывают число погибших, т.е. окрашенных клеток), количество погибших клеток
не должен превышать 5%.
Ставится контроль на отсутствие спонтанной дегрануляции:
ТК + трипановый синий - мертвые клетки < 5%.