Упрощенная HTML-версия
51
мые антигены должны индуцировать синтез ИФН-γ при инкуба-
ции с лимфоцитами, выделенными из селезенки лабораторных
мышей, инфицированных Mycobacterium tuberculosis, и не вызы-
вать такой реакции при инкубации с лимфоцитами мышей, ин-
фицированных БЦЖ или другими видами микобактерий.
Исследование различных синтетических пептидов в экспери-
ментальной модели, предложенной в лаборатории биотехнологии
НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова, позво-
лило разработчикам сделать несколько важных выводов:
a.
Большинство пептидов с интересующими разработчиков
свойствами были закодированы в RD1-области генома M. tu-
berculosis, в частности в области генов ESAT-6 и CFP-10.
b.
Уровень индукции ИФН-γ коррелировал с размерами иссле-
дуемых пептидов и был максимальным в случае использова-
ния пептидов размером 20 аминокислот и более.
c.
Использование нескольких полипептидов в одной реакции
усиливало уровень синтеза ИФН-γ.
Исходя из сделанных выводов, разработчиками нового теста
для диагностики туберкулеза было решено сконструировать
неприродный гибридный белок, содержащий полный набор анти-
генных детерминант ESAT-6 и CFP-10 M. tuberculosis и преду-
смотреть генетические модификации нового полипептида, облег-
чающие его выделение в условиях промышленного производства.
Созданный препарат представляет собой рекомбинантный
белок ESAT-6 – CFP-10, продуцируемый Escherichia coli DLT
1270 (производное штамма DH10B, имеющий lacI ген в хромосо-
ме).
Гены ESAT-6 и CFP-10 были амплифицированы на ДНК My-
cobacterium tuberculosis H38Rv с помощью праймеров: CFP-F-gc
gga tcc gat gac aaa gca gag atg aag acc gat gc и CFP-R-tca ggt acc gaa
gcc cat ttg cga gga ca; ESAT-F-gg ggt acc gat gac gat gac aaa aca gag
cag cag tgg aat ttc и ESAT-R-ccc aag ctt cta tga gaa cat ccc agt ga.
Полученные фрагменты были клонированы в плазмидный
вектор рQE30 (Qiagen), позволяющий экспрессировать белки с
добавлением 6 гистидиновых оснований (HIS) на N-конце.
Рекомбинанты отбирались с помощью рестрикционного ана-
лиза. Отобранный клон pQE30-esat-cfp обеспечивал синтез ги-
бридного белка ESAT-CFP ожидаемого размера около 27 кDa.