Упрощенная HTML-версия
10
Стадии постановки ПЦР
•
Подготовка проб биологического материала
•
Амплификация
•
Способ постановки ПЦР с использованием «горячего
старта»
•
Амплификация молекул РНК
•
Детекция
Варианты подготовки проб биологического материала (кипя-
чение, ферментный протеолиз с депротеинизацией и переосажде-
ние ДНК спиртом, использование сильного хаотропного агента –
гуанидина тиоционата, использование ионообменников типа
Chilex, применение детергентов или обработка материала щело-
чами с последующей их нейтрализацией.
Амплификация (Для проведения реакции амплификации
необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее ана-
лизируемый образец ДНК.). Важно учитывать некоторые особен-
ности отжига праймеров. В анализируемом биологическом об-
разце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым
используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некото-
рых случаях значительную, гомологию.
Способ постановки ПЦР
с использованием «горячего старта»
Внесение в реакционную смесь Taq-полимеразы во время
первого цикла после прогрева пробирки до температуры денату-
рации; разделение ингредиентов реакционной смеси прослойкой,
нр, парафина или воска на части (в нижней – праймеры, в верх-
ней – Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые смешиваются
при достижении температуры плавления материала прослойки
(~45-85ºС) использование моноклональных антител к Taq-
полимеразе.
Амплификация молекул РНК. Возможность использования
РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр
применения этого метода. Геномы многих вирусов (гепатит С,
вирус инфлюэнцы, пикорнавирусы и т.д.) представлены именно