Упрощенная HTML-версия
Последовательность
Включение оснований на:
дидезоксинуклозид вновь
трифосфата синтезированной
исходной
цепи
цепи
A Г Ц T
(в)
А
3
T
5
Ц
Г
Г
Ц
T
A
(б)
A
T
Г
Ц
Ц
Г
Ц
Г
T
A
(а)
A
T
Г
Ц
Г
5
Ц
3
3. Электрофоретическое разделение полученных фрагментов и радиоавтография
Фрагменты ДНК перемещаются в электрическом поле с различной скоростью: чем
короче цепь ДНК, тем быстрее она двигается. В геле цепи ДНК с различной подвижностью
образуют полоски. Наборы фрагментов ДНК из четырех пробирок разгоняют в геле
одновременно на четырех соседних дорожках. Дорожки геля с полосками фрагментов ДНК
называют
секвенирующей лестницей
. С ее помощью легко определить последовательность
оснований ДНК.
В настоящее время процесс автоматизирован. Гель с продуктами реакции
автоматически сканируется и компьютер печатает последовательность оснований.
Применение автоматических секвенаторов позволяет резко повысить эффективность
процесса и снизить стоимость.
П
ОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
(ПЦР)
Принцип метода полимеразной цепной реакции был разработан Кэри Мюллисом
(США) в 1983 г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований,
так и для диагностики в практическом здравоохранении.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) –
многократное увеличение числа копий
(амплификация) выбранного участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК – полимеразой.
При многократном повторении циклов синтеза происходит множественное увеличение
числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества
анализируемого материала получить достаточное количество ДНК – копий для
идентификации их методом электрофореза.
Для проведения амплификации необходимы:
1. ДНК – матрица или ее часть, содержащая искомый фрагмент
2. Праймеры – синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар),
комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического
фрагмента.
3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов – смесь четырех дНТФ, являющихся
материалом для синтеза новых цепей ДНК.
4. Фермент Tag-полимераза – термостабильная ДНК – полимераза, выделенная из
термофильных бактерий. Температурный оптимум Tag-полимеразы – 70-72° С.