Упрощенная HTML-версия
Блот-гибридизация – высоко чувствительный метод идентификации специфических
последовательностей ДНК, который широко используется в нескольких модификациях..
С
ЕКВЕНИРОВАНИЕ
Секвенирование
– определение нуклеотидной последовательности молекулы ДНК.
Существует два основных метода секвенирования: химическое (Максама – Гильберта) и
дидезоксисеквенирование (метод Сэнджера).
Этапы секвенирования по методу Сэнджера
1. Денатурация исследуемой ДНК
2. Синтез комплементарных цепей ДНК.
Синтез проводится одновременно в 4 пробирках. В каждой пробирке содержится:
исследуемая
одноцепочечная
ДНК,
праймер,
ДНК-полимераза
и
дезоксинуклеотидтрифосфаты (дATФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), один из которых является
радиоактивным, а также
терминатор
- один из 4 дидезоксинуклеотидтрифосфатов (ддАТФ,
– ОН
группы, в результате при присоединении терминатора к комплементарному основанию
синтез ДНК прекращается. Таким образом, в каждой пробирке получают набор
различающихся по длине меченых фрагментов ДНК.
Схема секвенирования и радиоавтографии
3
→
- X – X
– T
- X – X – X – X
– T
- X – X
– T
- 5
→
-
секвенируемая ДНК, терминатор - ддATФ
(а) 5
→
- X – X
– ддA
- 3
→
(б) 5
→
- X – X – А - X – X – X – X
– ддA
- 3
→
(в) 5
→
- X – X – А - X – X – X – X – А - X – X
– ддA
- 3
→