Упрощенная HTML-версия
5. Ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента.
Каждый цикл амплификации включает три этапа, протекающих в различных
температурных режимах.
1.
Денатурация ДНК (плавление)
– расплетение двойной спирали. Протекает при
90 – 93 оС в течение 30 – 40 сек.
2.
Присоединение праймеров (отжиг)
– на этом этапе температура реакционной
смеси снижается до 50 – 65 оС и происходит комплементарное связывание праймеров с
нитями матричной ДНК. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига.
Время отжига 20-60 сек.
3.
Синтез цепей ДНК (элонгация).
Комплементарный синтез цепей ДНК
начинается
с
участков
присоединения
праймеров.
Материалом
служат
дезоксинуклеотидтрифосфаты. Процесс катализирует Tag-полимераза при температуре 70-
72°. Время синтеза 20 – 40 сек.
Эти этапы повторяются многократно в программируемом термостате – амплификаторе
и позволяют получить огромное количество копий нужного фрагмента ДНК. В результате 20
циклов ДНК амплифицируется более чем в миллион раз. В качестве источника матричной
ДНК может быть использован любой материал, сохранивший в своем составе полный набор
фрагментов исходных молекул ДНК: высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови,
ворсины хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, культуры клеток, соскобы с
цитогенетических препаратов. Существуют различные модификации ПЦР: мультиплексная
ПЦР - одновременная амплификация нескольких участков матричной ДНК, метод PRINS –
реакция амплификации на хромосомных препаратах и т. д.
В настоящее время метод ПЦР используется:
– с целью диагностики возбудителей заболеваний, особенно трудно
культивируемых,
некультивируемых,
требующих
сложных
питательных
сред
микроорганизмов, внутриклеточных паразитов, вирусных инфекций (вирусный гепатит С и
В, ВИЧ)
– в исследовании генома (определение места локализации предполагаемых мутаций,
изучение других специфических особенностей ДНК), в молекулярной диагностике
наследственных болезней.