Упрощенная HTML-версия
Ход работы.
В четыре пробирки приливают по 0,2 мл раствора белка. В первые три
пробирки добавляют стандартные растворы с содержанием белка 25, 50, 100 г/л. Эти пробы
служат для построения калибровочной кривой. В четвертую пробирку наливают
исследуемый раствор с неизвестной концентрацией белка, которую нужно определить.
В каждую пробирку наливают по 4,5 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок
хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. для развития
окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на фотоколориметре, пользуясь зеленым
светофильтром (длина волны 540 нм) против воды.
Затем строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс известные
концентрации стандартных растворов белка, на оси ординат - соответствующие значения
оптической плотности.
Зная оптическую плотность исследуемого раствора белка с неизвестной
концентрацией, по калибровочной кривой находят в нем содержание белка.
Количественные методы определения белка:
нефелометрия и турбидиметрия
Растворы белка одновременно являются истинными и коллоидными растворами. С
коллоидным состоянием белков связан ряд характерных свойств, в частности явление
светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методами
нефелометрии и турбидиметрии.
Классическая теория светорассеяния, разработанная Релеем, рассматривает случай,
когда размер рассеивающей частицы мал по сравнению с длиной волны света, составляя 1/10
ее или меньше. Для фиолетового света с длиной волны 400 нм это составляет 40 нм, а для
красного – с длиной волны 700 нм размер релеевской частицы не должен превышать 70 нм.
Для сравнения: наибольший диаметр молекулы альбумина 8 нм, иммуноглобулина – 20 нм, а
длина молекулы фибриногена – 50 нм.
Судить о мутности раствора можно двумя способами: по количеству рассеянного
света и по количеству прошедшего; первый способ называется
нефелометрией
, второй –
турбидиметрией.
Каждый из этих способов имеет свои недостатки и преимущества.
Нефелометрия точнее и надежнее, так как позволяет зафиксировать даже небольшое
количество взвешенных частиц. При этом происходит заметное возрастание сигнала,
который в широких пределах пропорционален количеству взвешенных частиц.
Если же измерение проводят турбидиметрическим методом, то количество белка
должно быть таким, чтобы рассеялось не менее 10-20% света, иначе измерение будет
недостоверным. Кроме того, не известен физический закон, связывающий количество света,
прошедшего через мутный раствор, и число частиц. Поэтому калибровочные графики всегда
сугубо эмпиричны и трудно добиться хорошей воспроизводимости. Зато турбидиметрические
методы не требуют специального прибора, измерение можно проводить на любом фотометре
или спектрофотометре.
При нефелометрии абсолютное количество рассеянного света не имеет большого
значения, так как чувствительность прибора (нефелометра или флюориметра) обычно велика.
В связи с тем, что надо измерить количество светорассеивающих частиц безотносительно их
формы и размера, удобно работать в красной области спектра: длина волны больше, а спектр
частиц, которые ведут себя как релеевские, шире.
При выполнении турбидиметрического измерения, очень важно увеличить долю
рассеянного света, которая, согласно теории Релея, обратно пропорциональна четвертой
степени длины волны, т. е. в фиолетовой области значительно больше, чем в красной.