Стр. 46 - 2

44
MgCl2; 10 мМ 0,1% меркаптоэтанола; Triton Х-100; а также 30 пкмолей
каждого олигонуклотида; 125 мМ каждого dNTR («Сибэзим», г.
Новосибирск); 50-200 нг геномной ДНК и 1-2 ед. Taq полимеразы
(«Сибэзим», г. Новосибирск). Программа амплификации включала
стандартно предварительную денатурацию при 94°С в течение 5 минут с
последующими 30-35 циклами отжига при специфической для каждой пары
праймеров температуре (1 мин.), элонгации цепи при 72°С (1 мин.).
Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 5 минут. Для
разделения фрагментов ДНК использовали 2%-ный агарозный гель.
Продукты амплификации подвергали рестрикции соответствующими
эндонуклеазами. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза
в 2%-ном агарозном геле, содержащим 0,5 мг/мл этидиум бромида при
напряжении 120-130 В в течение 30-45 минут и визуализировали в УФ-свете.
Генотипирование полиморфизма гена IL-8 A(-251)→T
Генотипирование аллельных вариантов гена IL-8 (A/A; A/T; T/T)
осуществляли методом рестрикционного анализа продуктов амплификации
(ПДРФ-анализ) специфических участков генома. Детекцию полиморфизма –
А251Т проводили с помощью ПЦР с последующим расщеплением ПЦР
продукта рестриктазой RsaI. Структура праймеров: прямой: 5’-ATGA-
CTTCCA-AGCTG-GCC-GTG-3’, обратный 5’-TTATGA-ATTCTCA-GCCCT-
CTTCT-TCA-AAAACT-TCTC-3’. Амплифицированный профиль составлял
35 температурных циклов:
15 циклов при температуре 94o С;
20 циклов при температуре 66o С;
10 циклов при температуре 72o С.
После амплификации продукты ПЦР были разделены по размеру в 10%
полиакриламидном геле и проанализированы с помощью анализатора
флуоресцентных изображений. Полученные результаты сравнивали со
стандартным шаблоном.