Упрощенная HTML-версия
43
ПЦР-продукт радиоактивно метили посредством 1 цикла амплификации: в 20
мкл ПЦР-смеси содержалось: 1хПЦР-буфер, по 2 мкМ трёх немеченых dNTP,
[
33
P]dATP («Amersham», USA) в концентрации 2,1 мкМ (с уд. акт. 3000
Ки/моль). ПЦР-продукт, 1 мкМ каждого из праймеров и 0,5 ед.
Taq
-
полимеразы. После этапа полимеризации добавляли раствор четырёх dNTP
(по 0,2 мМ каждого) и дополнительно проводили реакцию полимеризации в
течение 1 мин. Меченный ПЦР продукт гидролизовали эндонуклеазой
Xho
II
с образованием фрагментов: 247, 108 и 280 пн. 3 мкл гидролизата
денатурировали в 9 мкл стоп-раствора (95% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05%
бромфенольный синий и 0,05% ксилен-цианол) при 95
о
С и затем помещали в
лёд до нанесения на гель. Пробы анализировали с помощью электрофореза в
8%-ном ПААГ (акриламид/бисариламид в соотношении 35:1). Гель содержал
90мМ трис-борат (рН 8,5), 2 мМ EDTA и 10%-ный глицерин. Электрофорез
проводили при 4
о
С и мощности тока 15 Вт. После высушивания гель
экспонировали с рентгеновской плёнкой в течение 24-36 ч.
Генотипирование полиморфизма гена IL-6 G(-174)→C
Детекцию полиморфизма –G174C гена IL-6 проводили с помощью ПЦР
с последующим расщеплением ПЦР продукта рестриктазой TaqII.
Мультиплексная ПЦР-амплификация фрагмента ДНК гена IL-6 проводилась
в 1 - мкл реакционной смеси, с использованием ТЕ-Taq-ДНК-полимеразы и
соответствующего готового буфера («Сибэнзим») с биотинилирванными
прймерами 5-GTT GTC ATC AGA CTT TGA CC -3, 5 – TTC AGT TCA TAT
GGA CCA GA - 3. Обратная гибридизация синтезированных ампликонов
проводилась путём химической денатурации амплифицированного продукта,
гибридизации одноцепочечных меченных биотином ампликонов с
мембранно-связанными зондами, промывания буферными растворами,
добавления конъюгата стрептавидин-щелочной фосфатазы, цветной реакции
на щелочную фосфатазу. Реакционная среда общим объёмом 20 мкл состояла
из буфера для проведения ПЦР («Сибэзим», г. Новосибирск), включающего в
себя следующие реагенты: 60 мМ Трис-НCl (рН 8,5); 25 мМ КCl; 1,5 мМ