Упрощенная HTML-версия
41
Генотипирование полиморфизма –C260T гена рецепторов
моноцитов CD14
Детекцию полиморфизма –C260T проводили с помощью ПЦР с
последующим расщеплением ПЦР продукта рестриктазой HaeIII. Структура
праймеров: прямой: 5’-TTGGT-GCCAA-CAGAT-GAGGT-TCAC-3’,
обратный 5’-TTCTT-TCCTA-CACAG-CGGCA-CCC-3’. Смесь для ПЦР
объёмом 25 мкл включала: 100 ng ДНК, 1×PCR буфер (75мM Трис-HCI (pH
9,0), 20мM (NH4)
2
SO4, 0,01 %Тween-20), 0,2 моль/л каждого праймера, 0,2
ммоль/л каждого dNTP, 1,5 ммоль/л MgC
l2,
и 1 ед. Тag полимеразы.
Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: 95°С/2 мин
– первый цикл, потом 35 циклов: 95°C - 30 сек, 60°C - 30 сек, 72°C - 30 сек,
последний цикл 72°C - 5 мин. Рестрикцию ПЦР-продукта длиной 561 пн
осуществляли 10 ед. рестриктазы HaeIII инкубацией при 37° C в течение 16
часов. Детекцию продуктов амплификации и рестрикции проводили методом
электрофореза в 4 % полиакриламидном геле с последующим окрашиванием
бромистым этидием.
Генотипирование полиморфизма
гена TNF-α (А/А, G/A, G/G) при G(-308)→A)
Детекция полиморфизма проводилась методом аллельспецифической
ПЦР. Структура праймеров: общий 5-tctctg-gtttc-ttctc-catcg-3, дикий 5-
atagg-ttttg-agggg-catgg-3, мутантный 5-atagg-ttttg-agggg-catga-3. ПЦР смесь
объёмом 12,5 мкл включала: Трис-HCI (pH 9,0) 75 мM, (NH4)
2
SO4 20 мM,
Тween - 20 0,01 %, каждого праймера по 0.5 мкM, по 0,2 мМ раствора
каждого из четырех dNTP, KCI 15 мM, MgCI2 1,5 мM, глицерин 4%, 2,5
единицы Тag полимеразы, 0,2-0,5 мкг ДНК.
Детекция ПЦР продукта проводилась методом электрофореза в 4%
полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием.
Определение аллелей гена TNF-α проводили по наличию или отсутствию в
геле фрагмента размером 184 п.н. В случае, если фрагмент выявлялся при
амплификации с обеими парами праймеров, то это свидетельствовало о
присутствии обоих аллелей в генотипе индивида. Следовательно, носитель
образца ДНК - гетерозигота. Амплификация фрагмента только с одной парой
праймеров и отсутствие амплификата при использовании другой пары
свидетельствовало о гомозиготном состоянии по соответствующему аллелю.
Параметры температурных циклов:
95
о
С – 1 мин
62
о
С – 1 мин 10 циклов