Упрощенная HTML-версия
функционирования ферментативного антиоксидантного звена, которое защищает клетку от
пероксидного стресса.
В качестве объекта исследования использовали белых лабораторных крыс (
Rattus rattus
L.) массой 200-250 г., содержащихся на стандартном режиме вивария. Печень у животных
извлекали после многократного перфузирования физиологическим раствором. Активность
фермента определяли спектрофотометрически на СФ-56 при 340 нм в 50 мМ калий-фосфатном
буфере (pH 7,4), содержащем 0,13 мМ NADPH, 0,37 мМ H2O2, 40 мМ восстановленного
глутатиона, 1 ед/мл глутатионредуктазы. О скорости протекания реакции судили по
уменьшению оптической плотности опытных образцов в результате окисления NADPH в ходе
протекания сопряженных ферментативных реакций: образования окисленного глутатиона под
действием ГП, и его последующего восстановления, взаимосвязанного с окислением NADPH
под действием глутатионредуктазы. За единицу ферментативной активности (Е) принимали
количество фермента, катализирующее образование 1мкмоль продукта за 1 мин. при 25oС.
Активность фермента выражали в виде удельной активности. Содержание белка определяли по
методу Лоури. Данные считали достоверными при р<0,05.
Очистка ГП включала несколько этапов. Навеску ткани печени измельчали и
гомогенизировали в 3-х кратном объеме охлажденной среды выделения следующего состава:
100 мМ трис-НСl-буфер (рН 7,8), сод
-меркаптоэтанол. Гомогенат
центрифугировали при 10000g в течение 12 мин. Полученный супернатант использовали в ходе
дальнейших исследований. Для освобождения ферментного препарата от низкомолекулярных
примесей применяли гель-фильтрацию на сефадексе G-25 (Fine, размер колонки 1,8х20 см). В
качестве элюирующей среды использовали 10 мМ трис-HCl (рН 7,8), содержащий 0,5 ммоль/л
ЭДТА, 0,01% в-меркаптоэтанол. Скорость элюции через сефадек G-25 составляла 25-30 мл/час,
ее регулирование осуществлялось путем изменения гидростатического давления. Каждую
полученную фракцию, объемом 3 мл, анализировали на присутствие ферментативной
активности. Фракции, обладающие максимальной ферментативной активностью, объединяли и
использовали для дальнейшей очистки. Обессоленный раствор фермента наносили на колонку с
ДЭАЭ-целлюлозой (размер колонки 1,2х15 см), уравновешенную буфером. Скорость элюции
через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой составляла 30 мл/час. Для очистки ГП использовали
ступенчатый градиент концентраций KCl (50-100 мМ) в элюирующем буфере.
С помощью разработанной процедуры очистки был получен ферментный препарат ГП с
21-кратной степенью очистки и удельной активностью 0,17 E/мг белка. Выход составил 7 %.
Полученный препарат был использован для исследования кинетических свойств фермента.
Показано, что ГП проявляет максимальную ферментативную активность в диапазоне рH 7,2-7,6,
рH оптимум составляет 7,4. Уменьшение рH до 6,8 или увеличение его до 8,0 приводит к
резкому снижению активности фермента.
Установлена гиперболическая зависимость начальной скорости реакции от концентрации
субстрата. Значение Km для глутатиона составило 0,37 мМ.
Таким образом, получение очищенного препарата ГП позволило определить некоторые
кинетические параметры каталитического действия фермента.
О.В. Яценко, А.А. Литвинов, Т.В. Садыкова,
Е.Р. Шурыгина, Я.В. Тивон
ВЛИЯНИЕ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НЕЙРОМЕДИАТОРНЫХ АМИНОКИСЛОТ
НА УСТОЙЧИВОСТЬ ЖИВОТНЫХ К ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ