Упрощенная HTML-версия
6.11.3.3. Изучаемые концентрации
Для изучения канцерогености испытуемого вещества в качестве максимальной
используют минимальная токсическая доза. Для ее определения используемые для скрининга
клетки сажают в лунки пластиковых плат в концентрации, обеспечивающей 30% монослоя
через 48 часов. Для быстрорастущих клеток эти параметры могут быть другими, их
подбирают экспериментально. Через 48 часов после посева в лунках, кльтуральную среду
заменяют средой, содержащей различные концентрации испытуемого вещества (обычно
вначале с шагом 1/10, а затем 1/2, по две лунки на каждую концентрацию). Водорастворимые
вещества непосредственно перед опытом растворяются в культуральной среде.
Нерастворимые в воде вещества обычно растворяют в диметилсульфоксиде. Обязательно
наличие контроля на растворитель и чистого контроля без каких-либо добавок (минимум по 2
лунки). Учет результатов проводят от 3-го до 7-го дня после добавления испытуемого
вещества по характеру гибели клеток.
6.11.3.4. Контроли
В каждом эксперименте необходимо наличие контролей. Негативный контроль:
необработанная культура и растворитель.
В качестве позитивного контроля может быть использован 20-метилхолантрен, либо
другой известный канцероген, предпочтительно того же ряда, что и тестируемое соединение,
испытанный ранее в культуре клеток.
6.11.3.5. Проведение эксперимента
В чашки Петри диаметром 50-60 мм на приготовленную «кормилку» высевают от 300
до 1000 клеток-мишеней и через 24 часа добавляют испытуемое вещество в концентрациях с
шагом 1/2, с максимальной концентрацией, которая оказалась минимально токсичной в тесте
на токсичность. Контролями служат чашки с растворителем в максимальной для данной
серии концентрации (в случае ДМСО не более 0,5%), чашки без какого-либо воздействия, и
чашки с заранее известным канцерогеном в работающей концентрации (положительный
контроль). При работе с эмбриональными клетками хомяка, клетки выращивают в течение
9суток без замены среды, после чего культуру отмывают любым солевым раствором и
окрашивают принятым в лаборатории методом. При работе с клетками иммортализованных
клеточных линий, культуру отмывают от канцерогена через 24-48 ч или позже, а затем клетки
культивируют 4-6 недель без пересева, сменяя среду 1-2 раза в неделю. После этого чашки
промывают и окрашивают, как и в тесте с использованием эмбриональных клеток хомяка.
6.11.4. Данные и их представление
6.11.4.1. Оценка результатов
Данные представляют в виде количества трансформированных колоний на чашку. Как
для тестируемого соединения, так и для позитивных и негативных контролей, указывают
число колоний для каждой чашки, среднее количество трансформированных колоний для
каждой чашки и стандартное отклонение.
Все результаты должны быть подтверждены в независимом эксперименте. Для оценки
результатов тестирования используют соответствующие статистические методы.