Упрощенная HTML-версия
8
Компоненты реакционной смеси
Праймеры, Taq-полимераза,смесь дезоксинуклеотидтрифос-
фатов (дНТФ) дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуа-
нозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ),
идезокситимидинтрифосфата (дТТФ), буфер, анализируемый об-
разец.
Циклический температурный режим
(денатурация, отжиг, элонгация (синтез).
Денатурация.
На первом этапе необходимо расплести двой-
ную цепь ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную
смесь нагревают до 92-95°С, в результате чего двухцепочечные
молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочеч-
ных молекул. Отжиг.На втором этапе праймеры присоединяются
к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название
«отжиг» (от англ. «annealing»). Праймеры подбирают так, что они
ограничивают (фланкируют) искомый фрагмент и комплементар-
ны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответ-
ствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим,
что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда
находится тимин, а напротив гуанина – цитозин. Если это усло-
вие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит. После
отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй
цепи ДНК с 3'-конца праймера.
Элонгация (синтез)
На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят
до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи про-
должается с максимальной эффективностью. В случае близкого
значения температуры отжига праймеров и температуры оптиму-
ма работы фермента, становится возможным использовать двух-
этапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию.
Температурный цикл амплификации многократно повторяет-
ся (30 и более раз).
На каждом цикле количество синтезированных копий фраг-
мента ДНК удваивается.