Упрощенная HTML-версия
10
Способ постановки ПЦР с использованием «горячего старта»
Внесение в реакционную смесь Taq-полимеразы во время
первого цикла после прогрева пробирки до температуры денату-
рации; разделение ингредиентов реакционной смеси прослойкой,
нр, парафина или воска на части (в нижней – праймеры, в верх-
ней – Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые смешиваются
при достижении температуры плавления материала прослойки
(~45-85ºС) использование моноклональных антител к Taq-
полимеразе.
Амплификация молекул РНК. Возможность использования
РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр
применения этого метода. Геномы многих вирусов (гепатит С,
вирус инфлюэнцы, пикорнавирусы и т.д.) представлены именно
РНК. В их жизненных циклах отсутствует промежуточная фаза
превращения в ДНК. При выявлении РНК необходимо в первую
очередь перевести ее в форму ДНК. Для этого используют фер-
мент обратную транскриптазу, который выделяют из двух раз-
личных вирусов:
Аvian myeloblastosis virus
и
Moloney murine leu-
kemia virus.
Детекция.
Для правильной оценки результатов ПЦР важно
понимать, что данный метод не является количественным. Теоре-
тически продукты амплификации единичных молекул ДНК-
мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже
после 30-35 циклов.
Методы визуализации результатов амплификации
•
Метод горизонтального электрофореза
•
Метод вертикального электрофореза
•
Метод гибридизационных зондов
Проблема контаминации. Контаминация – попадание из
внешней среды в реакционную смесь специфических и неспеци-
фических молекул ДНК, способных служить мишенями в реак-
ции амплификации и давать ложноположительные или ложноот-
рицательные результаты.