Упрощенная HTML-версия
53
2.
Концентрация субстрата должна быть больше насыщающей,
при которой поддерживается максимальная скорость реак-
ции.
3.
Для сложных ферментов концентрация кофакторов и кофер-
ментов тоже должна превышать насыщающую.
4.
Стандартная температура для проведения ферментативной
реакции должна быть постоянной +25
о
С (измерение при дру-
гих температурах специально оговаривается в опыте).
Эти стандартные условия обеспечивают скорость реакции,
при которой изменение концентрации субстрата или продукта ре-
акции зависит только от количества добавленного в среду фер-
мента.
В клинико-диагностических лабораториях определение ак-
тивности ферментов в биологических жидкостях и тканях прово-
дится прежде всего с целью диагностики многих заболеваний и
оценки эффективности проводимых лечебных мероприятий. В
фармации оно необходимо для контроля качества ферментных
препаратов.
Лабораторная работа № 1:
«О
ПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ
ФОСФАТАЗЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ
»
Принцип метода.
Метод основан на способности фермента
гидролизовать эфирную связь в n-нитрофенилфосфате. Освобож-
дающийся n-нитрофенол в щелочной среде дает желтое окраши-
вание. Интенсивность окраски соответствует содержанию про-
дукта реакции и отражает активность фермента.
Ход работы.
В пробирку вносят 1 мл субстратно-буферного
раствора с рН 10,5, содержащий глицин, хлористый магний, n-
нитрофенилфосфат, гидроокись натрия. Прогревают в водном
термостате при 37
0
С в течении 5 минут. Прибавляют 0,1 мл сы-
воротки крови, перемешивают и инкубируют в течение 30 минут.
Реакцию прекращают добавлением 10 мл 0,02 н раствора щелочи.
Перемешивают содержимое пробирки и фотометрируют на КФК
при длине волны 405 нм (синий светофильтр) в кювете с толщи-
ной слоя 1 см против контрольного раствора.