Упрощенная HTML-версия
136
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Принцип метода полимеразной цепной реакции был разрабо-
тан Кэри Мюллисом (США) в 1983 г. и в настоящее время широ-
ко используется как для научных исследований, так и для диа-
гностики в практическом здравоохранении.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
– многократное увели-
чение числа копий (амплификация) выбранного участка ДНК, ка-
тализируемое ферментом ДНК – полимеразой.
При многократном повторении циклов синтеза происходит
множественное увеличение числа копий специфического фраг-
мента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализиру-
емого материала получить достаточное количество ДНК – копий
для идентификации их методом электрофореза.
Для проведения амплификации необходимы:
1.
ДНК – матрица или ее часть, содержащая искомый фраг-
мент
2.
Праймеры – синтетические олигонуклеотиды (20–30 нук-
леотидных пар), комплементарные последовательностям
ДНК на границах определяемого специфического фрагмента.
3.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов – смесь четырех
дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых цепей
ДНК.
4. Фермент Tag-полимераза – термостабильная ДНК – полиме-
раза, выделенная из термофильных бактерий. Температурный
оптимум Tag-полимеразы – 70–72
о
С.
5. Ионы Mg
2+
, необходимые для поддержания активности фер-
мента.
Каждый цикл амплификации включает три этапа, протекаю-
щих в различных температурных режимах.
1.
Денатурация ДНК (плавление)
– расплетение двойной
спирали. Протекает при 90 – 93
о
С в течение 30 – 40 сек.
2.
Присоединение праймеров (отжиг)–
на этом этапе темпе-
ратура реакционной смеси снижается до 50 – 65
о
С и проис-
ходит комплементарное связывание праймеров с нитями
матричной ДНК. Для каждой пары праймеров существует
своя температура отжига. Время отжига 20–60 сек.