Упрощенная HTML-версия
134
Определение положения искомого фрагмента геномной ДНК
методом авторадиографии.
Блот-гибридизация – высоко чувствительный метод иденти-
фикации специфических последовательностей ДНК, который
широко используется в нескольких модификациях.
Секвенирование
Секвенирование
–
определение нуклеотидной последова-
тельности молекулы ДНК. Существует два основных метода се-
квенирования: химическое (Максама – Гильберта) и дидезоксисе-
квенирование (метод Сэнджера).
Этапы секвенирования по методу Сэнджера
1.
Денатурация исследуемой ДНК
2.
Синтез комплементарных цепей ДНК.
Синтез проводится одновременно в 4 пробирках. В каждой
пробирке содержится: исследуемая одноцепочечная ДНК, прай-
мер, ДНК-полимераза и дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), один из которых является радиоактивным, а
также
терминатор –
один из 4 дидезоксинуклеотидтрифосфатов
(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). От дезоксинуклеотидов они от-
личаются отсутствием 3
– ОН группы, в результате при присо-
единении терминатора к комплементарному основанию синтез
ДНК прекращается. Таким образом, в каждой пробирке получают
набор различающихся по длине меченых фрагментов ДНК.
Схема секвенирования и радиоавтографии
3
– X – X
– T
– X – X – X – X
– T
– X – X
– T
– 5
–
секвенируемая ДНК, терминатор – ddATP
(а) 5
– X – X
– ddA – 3
(б) 5
– X – X – А – X – X – X – X
– ddA – 3
(в) 5
– X – X – А – X – X – X – X – А – X – X
– ddA
– 3