Упрощенная HTML-версия
Для культивирования риккетсий могут быть использованы как первично
трипсинизированные, так и перевиваемые культуры клеток. Большинство видов риккетсий
размножаются в культурах клеток почечного эпителия, мезотелия, перевиваемых линиях
клеток Vero, HeLa, Hep-2, L929. Коксиеллы Бернета хорошо размножаются также в культурах
фибробластов куриного эмбриона и морских свинок, макрофагов и ретикулярных клеток
костного мозга и селезенки. Получены данные о возможности культивирования на культурах
клеток Vero и Hep-2 риккетсий, не культивируемых на традиционных моделях – морских
свинках и куриных эмбрионах (
R.tarasevichiae,
риккетсии подгруппы
R.massiliae
).
Для пассирования культуры клеток подвергают версенизации по стандартной методике.
Культуры клеток Vero и Hep-2 выращивают в стеклянных флаконах, засев проводят в
концентрации 150 тыс. клеток на 1мл. В качестве питательной среды используют среду Игла
МЕМ с двойным набором аминокислот, к общему объему добавляют до 10% эмбриональной
сыворотки. Подготовленные флаконы заражают 10% риккетсиальной суспензией в объеме 0,5
мл на флакон. Зараженные флаконы центрифугируют при 800 об/мин при температуре +22
0С в течение 30 мин, после центрифугирования во все флаконы добавляют среда поддержки
(Игла МЕМ с добавлением эмбриональной сыворотки до 1%) в объеме 1,5 мл на флакон.
Флаконы с зараженными клетками культивируют в углекислотном термостате при
температуре 35,6 0С в течение 8 суток. После завершения инкубации все флаконы
подвергают замораживанию в низкотемпературном холодильнике на -20 0С, а потом
оттаиванию, для разрушения клеток и максимального выхода из них микроорганизмов. После
оттаивания, материал центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин, супернатант в объеме
0,5мл берут на следующий пассаж, а из 0,2 мл делают мазки, остатки супернатанта хранят в
криопробирках в низкотемпературном холодильнике. Инфицированность и стерильность
культуры клеток определяют в мазках, окрашивая их по Романовскому-Гимза и методом
флюоресцирующих антител. Отсутствие посторонней микрофлоры в пассажах
контролируется также посевом на питательные среды (сахарный бульон, тиоглтколевая
среды, среда Сабуро, среды на микоплазмы).
Развитие инфекции в клеточных культурах у различных видов родов
Rickettsia
и
Orientia
отличается. Для риккетсий Провачека и ориенций цуцугамуши характерно накопление
микроорганизмов в больших количествах в отдельных клетках. Дегенеративные изменения
клеток вследствие перепроизводства возбудителя сопровождаются их разрывом и
освобождением микроорганизмов с распространением инфекции на соседние клетки.
У риккетсий группы КПЛ накопление возбудителя в отдельных клетках не
сопровождается их переполнением, риккетсии еще на ранней стадии выходят из клеток без
существенных их повреждений с быстрым распространением инфекции клеточной культуры.
Дегенеративные изменения клеток обусловлены преимущественно токсическим действием
риккетсий.
Методы выделения и последующей идентификации риккетсий требуют специальной
подготовки, соблюдения режимных требований (возбудители 2-3 группы патогенности). К
возбудителям второй группы патогенности относят
R.prowazekii, Coxiella burnetii, R.rickettsii.
Их культивирование можно осуществлять в специализированных риккетсиологических
лабораториях или лабораториях особо опасных инфекций, что ограничивает возможности
использования методов выделения риккетсий в диагностических целях.
При изучении штаммов риккетсий придерживаются общей схемы дифференциации,
предложенной П.Ф. Здродовским и Е.М. Голиневич (1972), которая включает:
а) изучение морфологии;
б) характеристику размножения при культивировании в желточных мешках куриных
эмбрионов;
в) воспроизведение экспериментальной инфекции на лабораторных животных;