Упрощенная HTML-версия
Лабораторная работа №1:
«РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ АМИНОКИСЛОТ НА
БУМАГЕ»
Хроматография - один из эффективных и широко применяемых в биохимических
исследованиях методов разделения аминокислот. Для проведения хроматографии используют
систему растворителей, один из которых является подвижной фазой, а другой неподвижной.
В зависимости от направления фронта передвижения растворителя различают
следующие виды хроматографии: восходящую, нисходящую, одномерную, двухмерную и
радиальную. Расположение отдельных аминокислот обнаруживают после проявления
хроматограмм. Для этого высушенную бумагу обрабатывают раствором нингидрина и
помещают в сушильный шкаф при 100 оС, т.е. проводят качественную нингидриновую
реакцию на аминокислоты, находящиеся на бумаге.
Скорость перемещения аминокислот выражают коэффициентом Rf, который
представляет собой отношение расстояния, пройденного данной аминокислотой, к пути,
пройденному фронтом растворителя
,
где
а – путь, пройденный аминокислотой (расстояние от линии старта до центра
пятна);
в – путь, пройденный растворителем (расстояние от линии старта до линии
фронта).
Принцип метода.
Метод основан на разной скорости передвижения аминокислот на
бумаге в зависимости от коэффициента распределения их между неподвижной (вода) и
подвижной (фенол) фазами растворителя.
Чем больше растворимость аминокислоты в водной фазе и чем меньше ее
растворимость в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота по
сравнению с фронтом органического растворителя. Более гидрофобная аминокислота, лучше
растворяющаяся в неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта,
чем гидрофильная аминокислота.
Порядок выполнения работы .
Квадрат хроматографической бумаги делят двумя
диагональными линиями на 4 сегмента ,проводят линию старта. Затем в каждый сектор
наносят стеклянной палочкой небольшое количество (1-2 капли) исследуемых растворов
аминокислот: аланина, глутаминовой кислоты, лейцина, а также гидролизат. После нанесения
растворов аминокислот хроматограмму подсушивают на воздухе и помещают в чашку Петри
(камера), где, налита система растворителей (фенол, вода), закрывают ее крышкой и проводят
разделение в течение 40-50 минут. При этом происходит разделение исследуемой смеси на
отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью, соответственно коэффициенту их
распределения между водой и фенолом.
Через 40-50 минут хроматограмму подсушивают в термостате при температуре 95 оС
(10 минут) и обрабатывают раствором нингидрина, после чего вновь подсушивают в
сушильном шкафу в течение 5 минут при температуре 95 оС. При этом проявляются
аминокислоты в виде отдельных полос. Для каждой из них рассчитать коэффициент
распределения Rf и сделать вывод о подвижности аминокислот.
Клинико-диагностическое значение определения аминокислот
в сыворотке крови и моче
Хроматографический анализ свободных аминокислот в сыворотке крови и моче
применяется в клинике для диагностики наследственных заболеваний обмена аминокислот.