Упрощенная HTML-версия
Метод основан
на определении содержания 4-аминофенола, образующегося при
гидроксилировании анилина в монооксигеназной цепи микросом с участием цитохрома Р450
микросомальная
цепь
H2N – + НАДФ Н2 + О2
H2N – – ОН + НАДФ+ + Н2О
анилин
(Р450) 4-аминофенол
4-аминофенол при взаимодействии с фенолом и в присутствии карбоната натрия
образует окрашенный индофенольный комплекс синего цвета:
НО – – N= =О
Э
ТАПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
:
1. Выделение микросомальной фракции из печени крыс
Метод основан на разной скорости осаждения субклеточных частиц печени при
центрифугировании в зависимости от их размера и плотности. Для уменьшения фактора
осаждения микросом добавляется хлорид кальция, вызывающий их преципитацию.
Ход определения
.
После забоя животного печень отмывают от крови раствором
хлорида калия (1,15% раствор) из шприца, обсушивают ее фильтровальной бумагой и
помещают в чашку Петри, стоящую на льду.
3 г ткани печени измельчают ножницами и переносят в стакан гомогенизатора, куда
предварительно наливают 9 мл охлажденногораствора хлорида калия. Стакан помещают в
лед и гомогенизируют с тефлоновым пестиком при 1000 об/мин в течение 40 сек.
Гомогенат разливают в две центрифужные гильзы и центрифугируют на ЦЛР при 10
000 g в течение 20 мин. при 0-40С. Надосадочную жидкость сливают в другие центрифужные
гильзы, прибавляют раствор хлорида кальция в соотношении 1: 5 по объему. Перемешивают
и вновь центрифугируют при 3000 g в течение 15 мин при 0-40С.
Надосадочную жидкость сливают. К осадку, содержащему обогащенную фракцию
микросом, добавляют 3 мл раствора трис-буфера (0,1 М раствор с рН 7,4) и с помощью
пипетки, втягивая и выдувая жидкость, получают взвесь микросом.
2. Изучение гидроксилирования анилина
Для изучения гидроксилирования анилина берут две чистые пробирки и готовят
контрольную и опытную пробы. Последовательность внесения компонентов и их объем
приведены в таблице.