Стр. 4 - 2

4
4
часов. Также была сформирована группа контроля – субъекты до 35 лет погибшие в
результате насильственной смерти, без признаков употребления наркотических веществ
внутривенно – 100 человек, давность наступления смерти которых на момент осмотра трупа
в морге также не превышала 12 часов. В обеих группах проводился забор крови с
антикоагулянтом и последующим получением взвеси лейкоцитов, из которых выделяли ДНК
методом перхлоратной экстракции с этанольным содержанием.
Использованы олигонуклеотидные праймеры, синтезированные в Институте
химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Программа
амплификации приведена в таблице:
Программа амплификации
CYP2D6 CYP2C19
CYP2D6*3*4 CYP2C19*2*3
95 ˚ C 3 мин 1 цикл 95 ˚ C 3 мин 1 цикл
95 ˚ C 5 с
40 циклов
95 ˚ C 5 с
40 циклов 66 ˚ C 5 с 64 ˚ C 5 с
72 ˚ C 5 с 72 ˚ C 5 с
72 ˚ C 2,5 мин 1 цикл 72 ˚ C 2,5 мин 1 цикл
20 ˚ C Хранение 20 ˚ C Хранение
Амплификацию проводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl (pH 8,9), 50мМ
КCl, 1,7мМ MgCl, 0,05% Tween 20, с добавлением 0,2 мМ-ого раствора dNTP, 0,5 мкМ-го
раствора праймеров, 20нг ДНК и 1,0 ед. акт. Taq- ДНК-полимеразы. Реакционную смесь в
объеме 20мкл покрывали 40мкл минерального масла. ПЦР проводили на амплификаторе
«Терцик» («ДНК-Технология», Москва).
Структура олигонуклеотидных праймеров
Ген Мутация U R
CYP2D6 CYP2D6*3 GGATGAGCTGCTAACTGAGCсC CCCAAАCCTCCAATTCTGС
CYP2D6 CYP2D6*4*6 GGCAAGAAGTCGCTGGAcCAG
Ген мутация U R
CYP2С19 CYP2С19*3 GGATAGCTGCTAACTGAGCcC CCCAAAACCTCCAATTCTGC
CYP2С19 CYP2С19*2 GGCAAGAAGTCGCTGGAcCAG TTACCTTCTCCATTTTGATCcG