Упрощенная HTML-версия
50
2.5. Молекулярно-генетические методы исследования (метод
полимеразной цепной реакции)
Метод использовали для исследования полиморфизма генов
интерлейкина-1β (IL-1β C+3953T, C-511T), рецепторного антагониста
интерлейкина-1 (IL-1RN VNTR во 2 интроне), фактора некроза опухолей-α
(TNF-α G-308A), интерлейкина-10 (IL-10 G-1082A) в лейкоцитах
периферической крови.
Определение полиморфизма генов проводили в лаборатории кафедры
патологической анатомии ОмГМА.
Проводили забор венозной крови (4-5 мл) в пробирку системы
Vacutener (BD, США) с антикоагулянтом и последующим получением взвеси
лейкоцитов, из которой выделяли ДНК методом методом фенол-
хлороформной экстракции с этанольным осаждением [Johns M.B. et al., 1989].
Для этого отмытый клеточный осадок лейкоцитов ресуспендировали в 500
мкл буфера для выделения ДНК (100 μM Tris-HCl (pH=8), 100 μM NaCl, 10
μM ЭДТА), добавляли 50 мкл 10% раствор додецилсульфата натрия и 10 мкл
0,01% протеиназы К, тщательно перемешивали. Инкубировали 2 часа при
55
0
C. Затем добавляли 200 мкл фенола и 200 мкл хлороформа, тщательно
перемешивали и центрифугировали 15 мин при 10000 об/мин. При этом
содержимое пробирки расслаивалось на 2 фазы. Верхнюю фазу переносили в
чистую пробирку, не трогая нижнюю и интерфазу (в случае если это
происходило, процедуру повторяли заново). Далее к ней добавляли 300 мкл
хлороформа, перемешивали и центрифугировали 5 мин при 10000 об./мин.
После чего вновь отбирали верхнюю фазу и переносили ее в чистую
пробирку, добавляли 50 мкл 3М ацетата натрия (pH=5,4), перемешивали.
Затем добавляли 1000 мкл 96
0
этанола, перемешивали, инкубировали 10 мин
при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин на максимальной
скорости (13000 об/мин). Супернатант удаляли, осадок промывали 200 мкл