Упрощенная HTML-версия
лежат манипуляции с нуклеиновыми кислотами, сделали возможным выделение отдельных
генов, выяснение их структуры, а также искусственное введение генов в организм.
Нуклеиновая кислота может быть выделена из любого типа тканей и клеток,
содержащих ядра. Этапы выделения включают разрушение клеток, удаление фрагментов
клеточных органелл и белков, концентрирование молекул нуклеиновых кислот с помощью
хроматографических
методов
очистки
нуклеиновых
кислот
(ионообменная,
распределительная, гель-проникающая хроматография).
Р
ЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
Для того, чтобы выделить ген для последующей идентификации, необходимо
разрезать полученную клеточную ДНК на относительно небольшие фрагменты.
Фрагментация молекулы ДНК (обеих нитей) –
рестрикция
- достигается с помощью ДНКаз-
эндонуклеаз, называемых ферментами рестрикции (
рестриктазами
). Каждая рестриктаза
узнает специфическую последовательность оснований – длиной в 4 – 6 пар. Места
локализации этих последовательностей в молекуле ДНК называют
сайтами рестрикции
.
Таким образом происходит упорядоченный гидролиз ДНК. Под действием некоторых
рестриктаз расщепление ДНК может происходить не прямым разрезом через обе цепи ДНК, а
с образованием ступенчатых («липких») концов.
- Х – Х – G – A – A – T – T – C – X – X –
- X – X – C – T – T - A – A – G – X – X –
рестрикция
- Х – Х – G
A – A – T – T – C – X – X –
- X – X – C – T – T - A – A
G – X – X-
«липкие» концы
В результате, используя определенный набор рестриктаз, можно разрезать ДНК в
строго установленных местах и получить заданные фрагменты.
Г
ИБРИДИЦАЗИЯ
Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по
длине путем электрофореза в геле.
При полной рестрикционной обработке ДНК эукариот получается слишком много
фрагментов различной длины, так что не всегдаудается определить отдельные участки
нуклеиновой кислоты на электрофореграмме. Идентификация нужных фрагментов ДНК в
таком случае возможна только путем гибридизации. Метод
гибридизации (ренатурации)
основан на образовании водородных связей между нуклеотидами однонитевого фрагмента
молекулы анализируемой ДНК и комплементарными им нуклеотидами ДНК-зондов.
Зонд гибридизации
– короткий фрагмент ДНК (длиной около 20 нуклеотидов),
последовательность оснований которого комплементарна известной последовательности в
молекуле ДНК. Зонды могут быть искусственно синтезированы или выделены из генома. Для
облегчения последующего обнаружения зонда в него вводится радиоактивная или